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超聲波破碎細胞的常見問題有哪些

  更新時間:2011-07-26 點擊量:2091
       大腸桿菌表達外源蛋白,在超聲破碎的時候,用含有1%triton-X-100的PBS懸浮,然后超聲的效果較好,1%triton-X-100的作用還是很明顯的,對其他的一些細菌同樣起作用,比如鏈霉菌。
      細菌沉淀直接加樣品1buffer,再加5ul的巰基乙醇,混勻,離心,煮沸10min,直接上樣,染色脫色步驟如下:將膠放入適量的染色液微波爐里加熱1min(下次適當補點醋酸即可),將染色液換成大量的水(自來水即可)在微波爐煮10min就可以。 
      在表達重組蛋白后超聲波破碎細胞,采用冰浴,400w,破2s停1s,但是不一會就產生大量泡沫,影響了破碎功率,pbs和tris緩沖液都是這樣,zui后都是破碎不*,而我的目的蛋白就在這些未破碎的細胞中。

1.會產生氣泡是因為你的探頭位置沒放好。探頭一定要接近底部,約1cm(我一般是距底部0.5mm)。功率根據儀器不同會有所不同,但你可以觀察液面,有波動但不要太劇烈就好。

2.破3S停10S,破個二三十次看看。

3.變幅桿位置擺放也要注意,聽聲音如果不對的話就要及時調整。另外可以從菌濃度方面考慮。在破碎時試著加大體積,強度不要超過60%.

4.嘗試超8s停8s,對有些菌體蛋白來說,你的方法很難散熱,導致蛋白變性產生氣泡,停頓時間稍長一些,這種情況多見于包涵體形式的蛋白。

鏈霉菌(放線菌)超聲破碎的,用的方法條件是什么?

前處理一般就是配置成一定濃度的菌懸液。
 
使用超聲破碎時采用的具體條件是:
(1)取細菌的24h培養液于5000r/min下離心5min收集菌體.
(2)用pH7.5的Na2HPO-NaH2PO緩沖液洗滌3次,再用該緩沖液將菌體配成1:3的菌懸液.置于40mL大塑料試管內.
(3)將大塑料試管置于冰浴中,采用超聲波破碎(功率200W,1/2”探頭,破碎30s,間歇30S).
(4)破碎液于12000r/min下高速冷凍離心30min,收集細胞碎片和上清夜.
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